Как PCR тестът с цитонамазка помага за диагностициране на коронавирусната инфекция и защо понякога резултатът се оказва фалшиво отрицателен?

Отговорите дава  Милена Василева за zdrave.to.

Общо изследване на урината, на кръвта, биохимия - този набор от тестове ни е познат, тъй като именно те се предписват най-често от терапевтите. По-специфичните изследвания са ни по-малко познати - включително PCR тестът.

Коронавирусът промени ситуацията: уви, твърде много от нас са изправени пред необходимостта да се изследват и след това нервно да очакват резултата. Затова днес ще ви разкажем какво е PCR тестът и как работи?

Как означава съкращението PCR?

PCR е полимеразна верижна реакция. Може да ви се стори, че думите “верижна реакция“ се отнасят до нещо химично, ядрено и експлозивно, но нищо подобно. Този тест използва метода на ДНК веригата (дезоксирибонуклеинова киселина), откъдето идва и името му.

При лабораторен тест, използващ PCR, съвсем малка проба от ДНК може бързо да се превърне в милиони копия, за да бъде разпозната и проучена задълбочено. Ето защо PCR се използва за откриване на опасни патогени, които могат да се “скрият” от другите лабораторни тестове.

Полимеразната верижна реакция направи революция в началото на 80-те години, когато беше разработена за първи път. Създателят й, биохимикът Кари Мулис, получи Нобелова награда за химия за своята работа през 1993 г.

Как работи PCR?

1. Първата стъпка на PCR е създаването на праймери. Това са къси последователности от молекули, които съвпадат с краищата на ДНК пробата, която трябва да се открие. Например, ако тестовете са за COVID-19, тогава в проучването ще бъдат използвани готови “опашки” от РНК на коронавируса.

2. Следващата стъпка във верижната реакция на полимеразата е нагряване на пробата. Топлината кара двойната спирала на ДНК да се раздели на две единични нишки в процес, наречен денатурация на нуклеиновата киселина.

3. Температурата се понижава и се смесва разделената ДНК с праймерите. Тези, които съвпадат с краищата на веригите, бързо се свързват с тях, образувайки шаблон.

4. Следващата стъпка е ДНК полимераза - специален ензим, който участва в репликацията на ДНК. С други думи, това вещество се свързва с шаблона и създава негово копие. Имали сме една ДНК проба, а сега са станали две. В молекулярната биология това се нарича амплификация (от лат. аmplificatio - усилване, увеличаване).

5. Пробата се загрява още веднъж, ДНК веригите отново ще се разделят на две нишки - и целият процес се повтаря. От две вериги на ДНК получаваме четири, след това осем, шестнадесет - и така, докато количеството на генетичния материал е достатъчно. Обикновено са необходими 20 до 40 цикъла, за да се разбере дали е налице ДНК на прицелния патоген.

Всички етапи на полимеразната верижна реакция - денатурация на ДНК, прилагане на праймери и удължаване на ДНК, протичат при различни температури. Това означава, че след като се формира “изходната смес”, стъпките могат да бъдат контролирани чрез процес, известен като “термично циклиране”. Това означава, че температурата се поддържа на нужното ниво точно толкова, колкото е необходимо за завършване на всяка стъпка. С използването на специално оборудване човешкото участие е минимално, а точността на анализа е много висока.

Къде се използва PCR методът?

Обхватът на приложение на полимеразната верижна реакция е много обширен и не се ограничава само до определението на инфекции:

• клониране на ДНК за секвениране на генома

• клониране на ген

• филогенеза (изследване на историческото развитие на организмите)

• диагностика на наследствени заболявания

• изучаване на древна ДНК

• анализ на “генетични пръстови отпечатъци” (за ДНК профилиране)

• определение за родителство

• криминалистични изследвания и др.

Как работи PCR тестът за диагностика на коронавируса?

Изследването за определяне на коронавирусна инфекция е същото, както и при всеки друг патоген. Взема се намазка от назофаринкса, за да се определи дали РНК на вируса присъства върху лигавиците. Ако резултатът е положителен, болният е опасен за другите, което означава, че трябва да остане под карантина.

Как да се подготвим за вземане на PCR цитонамазка за коронавирус?

Три часа преди PCR теста не трябва да ядете или пиете, да миете зъбите си, да използвате вода за уста и спрейове, да дъвчете дъвка, да пушите.

Каква е точността на PCR тестването за коронавирус?

Проучване, проведено в Американския университет “Джон Хопкинс” и публикувано през август 2020 г., показва, че всеки пети извършен PCR тест е фалшиво отрицателен.

Степента на точност зависи от стадия на инфекцията, като най-висок е процентът на фалшивите негативи, регистрирани през първите четири дни след заразяването. Ако изследването се случи на осмия ден от инфекцията (обикновено, три дни след началото на симптомите), резултатите са по-точни.

За да оценят точността на теста, учените са анализирали данни от седем предишни проучвания, в които са изследвали 1330 назофарингеални намазки от пациенти. След това специалистите сравняват данните от PCR теста с историята на контактите и времето на поява на симптомите при пациентите. Ето колко са били фалшиво отрицателните резултати:

• на първия ден след заразяването - 100%

• на четвъртия ден - 67%

• на петия ден - 38%

• на осмия ден - 20%

След осмия ден точността на тестовете отново започна да спада. С други думи, при коронавирус PCR тестването е ефективно в доста тесен “прозорец” - ако изследването е направено твърде рано, няма да покаже нищо, както и тест, проведен твърде късно, дори ако има симптоми.

Ако знаете кога може да сте се заразили, опитайте да се тествате около 8 дни след тази дата или на третия ден след появата на симптомите. И ако резултатът е отрицателен при наличие на очевидни признаци на коронавирусна инфекция, тогава е по-добре да не рискувате и да си останете вкъщи, докато симптомите напълно изчезнат.

Защо PCR тестовете за COVID-19 невинаги са точни?

Специалистите посочват, че една от причините за големия брой фалшиво отрицателни резултати може да е вариабилността в изолирането на вируса. Ако изследването е направено твърде рано, вирусът може да няма време да се отдели в устата и носоглътката. Ако е направен твърде късно, вирусът е “слязъл” надолу, в бронхите и белите дробове.

Методите за вземане на проби също могат да бъдат неправилни. Например, ако цитонамазката не е взета достатъчно “дълбоко“ или ако пациентът е пил вода преди това. Проблемът може да е и в недостатъчно качествените реактиви.

Как се диагностицира коронавирусът, ако тестът се окаже фалшиво отрицателен?

В този случай на лекарите помага оценката на симптомите, търсенето на маркери на възпаление (като С-реактивен протеин), компютърна томография на гръдния кош и ензимно-свързан имуносорбентен анализ за антитела срещу коронавируса.

Въпреки че PCR тестовете не са на 100% успешни, те все още са от съществено значение за проследяване на нарастването на честотата и справяне с пандемията.